METABOLOMIC STUDY OF EXTRACTS OF BRAZILIAN GEOPROPOLIS BY UHPLC-HRMS (ORBITRAP), 1H AND 13C NMR, AND GC-MS

Abstract

As abelhas sem ferrão (Meliponini) produzem própolis misturando resinas, ceras e óleos de fontes vegetais, com secreções salivares ricas em enzimas. Pequenas porções de partículas de solo são adicionados à mistura para dar à geoprópolis a consistência necessária para ser usada como parte de muitas estruturas internas e externas da colmeia. Para proteger a colônia de influências externas patógenos, a geoprópolis apresenta diversos efeitos farmacológicos, especialmente antibióticos, antiviral, antifúngico. Geralmente, nos países pobres, as comunidades rurais menos assistidas de trabalhadores e indígenas se beneficiam dessas características da geoprópolis. Sua composição química é complexa e relacionada à origem geográfica, às fontes disponíveis e as espécies de abelhas sem ferrão. Em geral, a geoprópolis é rica em flavonóides, compostos fenólicos, fenilpropanóides, açúcares e lipídios. Apesar da importância deste produto natural, os estudos sobre o geoprópolis ainda são escassos e voltados para características pontuais, em poucas espécies, em vez de uma abordagem mais ampla em espécies maiores número de espécies. O objetivo deste estudo foi empregar a metabolômica e abordagens lipidômicas, através de técnicas cromatográficas hifenizadas e RMN em a fim de investigar a composição e possíveis biomarcadores da geoprópolis. Primeiramente, extratos etanólicos de geoprópolis (EEGs) de 14 espécies e duas subespécies de abelhas sem ferrão brasileiras, de cinco estados brasileiros (Paraná, Pernambuco, Maranhão, São Paulo e Sergipe). As amostras foram fornecidas por apicultores locais. Os EEG foram mantidos em freezer até serem transportados, em temperatura ambiente, para o Centro de Proteômica e Centro de Metabolômica do Instituto de Ciências Médicas de Londres (Imperial College Londres, campus Hammersmith), Reino Unido. As impressões digitais em massa dos EEGs foram adquiridos usando um espectrômetro de massa de alta resolução (HRMS, Orbitrap), em primeiro lugar por técnica de injeção de fluxo direto (FIA) e analisado usando análise multivariada, como PCA e HA. Além disso, possíveis correlações entre os dados de impressões digitais em massa e o total conteúdo de flavonóides (TFC) e capacidade antioxidante em termos de equivalente de quercetina (DPPH) e equivalentes de ácido ascórbico (VCEAC) foram avaliados por regressão PLS. Depois FIA, EEGs foram injetados em um UHPLC-HRMS e posterior partição com água e o clorofórmio permitiu a investigação da fração rica em lipídios CHCl3. A fração solúvel em água foi derivatizada e analisada por GC-MS. Desta forma, as potencialidades de cada técnica analítica foram exploradas para possibilitar uma análise abrangente de geoprópolis. O uso da identificação por GC-MS foi baseado na comparação de dados espectrais com a biblioteca interna do instrumento, também o índice de retenção foi calculado. No caso da anotação do composto UHPLC-HRMS foi baseada em espectrometria de massa sequencial experimentos e realizados pelo software Compound Discoverer V. 3.3 (Thermo), usando bibliotecas locais e online especializadas. A análise de composição por UHPLC-HRMS e GC-MS revelou a presença de flavonóides, açúcares, ésteres, terpenos, fenólicos, ácidos orgânicos e fenilpropanóides. A análise lipídica revelou a presença de ácidos graxos, acilos graxos, lipídios fenólicos, esteróides e resorcinóis. Análise Multivariada exploratória indicou que as espécies e gêneros de abelhas afetam fortemente a composição química de geoprópolis, bem como a origem geográfica. A extensão do último fator depende na espécie de abelha. Por um lado, observou-se que a geoprópolis da Tetragonisca angustula têm composição química semelhante, independentemente da origem geográfica, indicando que essa abelha reúne resinas vegetais semelhantes em todo o Brasil para fazer sua própolis. Por outro lado, Melipona quadrifasciata e Melipona marginata são vistas como tendo características generalistas, pois sua geoprópolis tem composição mais variável dependendo a origem geográfica. A análise de RMN do extrato CDCl3 (CEG) da geoprópolis permitiu a confirmação de classes químicas já identificadas por técnicas cromatográficas hifenizadas e também corroborou a importância das espécies de abelhas e da origem geográfica na composição química da geoprópolis. Finalmente a aplicação de modelos PLS às impressões digitais de massa da FIA utilizando menos de 3 variáveis ​​latentes produziu modelos precisos com valores baixos para os erros de calibração e predição (RMSEC < 0.79 mg.g-1; RMSECV < 2.662 mg.g-1; RMSEP < 1,0448 mg.g-1). Além disso, coeficientes de determinação aceitáveis (0.6613 < R² < 0.8815) indicam que impressões digitais em massa estimam com precisão o TFC e a capacidade antioxidante da geoprópolis.