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Tipo do documento: Dissertação
Título: DESENVOLVIMENTO DE IMUNOSSENSOR ELETROQUÍMICO PARA O MONITORAMENTO DE CÉLULAS CANCEROSAS
Autor: Almeida, Sthéfane Valle de 
Primeiro orientador: Galli, Andressa
Primeiro coorientador: Bernardi, Juliana Cancino
Resumo: Câncer é a segunda causa de morte no mundo, e foi responsável por cerca de 10 milhões de mortes em 2018, de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Diversos estudos apontam que a transferrina é um biomarcador canceroso em potencial, uma vez que células cancerosas expressam níveis de transferrina maiores que células saudáveis. Neste contexto, este trabalho descreve o desenvolvimento de um imunossensor eletroquímico para a detecção de transferrina (Tf), nas formas apo-Tf (não ligada à ferro) e holo-Tf (ligada à ferro). O imunossensor foi baseado na imobilização do anticorpo policlonal anti-transferrina (anti-Tf) pelo método de ligação covalente cruzada, empregando os agentes de comprimento zero 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e n-hidroxisuccinimida (NHS). Como superfície transdutora, placas de ITO (óxido de índio dopado com estanho) foram utilizadas e os resultados foram obtidos pela adequação dos dados experimentais ao circuito equivalente de Randles. Todas as medidas foram realizadas pela técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE), em meio de hexacianoferrato de potássio (II) 4 mmol L-1 preparado em tampão fosfato pH 7,4. A caracterização dos imunossensores foi realizada utilizando a técnica de EIE e voltametria cíclica (VC), avaliando assim a resposta eletroquímica de apo-Tf e holo-Tf. Observou-se que os dispositivos desenvolvidos foram capazes de detectar ambas as formas de Tf, em termos de resistência de transferência de carga (Rct). As melhores condições experimentais foram avaliadas para o desenvolvimento dos imunossensores, realizando estudos acerca da aferição da área geométrica do ITO, da ativação da superfície eletródica, do meio de imobilização ao anticorpo, do tempo de incubação e concentração de anti-Tf e do tempo de incubação de cada antígeno. Curvas analíticas foram construídas para cada antígeno, utilizando cinco níveis de concentração em duplicata. Realizou-se um estudo inicial para a validação completa dos dispositivos as figuras de mérito de limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ), precisão e linearidade, esta última avaliada estatisticamente por meio de regressão linear e teste de falta de ajuste no nível de 95% de confiança. Ademais, os imunossensores desenvolvidos foram aplicados na detecção de células cancerosas A549 (câncer de pulmão) e MCF-7 (câncer de mama), comparando-as com a linhagem celular saudável dos rins BHK. Visando avaliar se as respostas obtidas diferem estatisticamente das células de controle (BHK) foi realizada uma análise de variância (ANOVA) de um fator e um teste de Dunnett a um nível de 95% de confiança. Assim, foi observado que a resposta impedimétrica das células saudáveis difere significativamente da resposta das células cancerosas, indicando a potencialidade dos imunossensores para o diagnóstico de câncer. Deste modo, o dispositivo construído pode ser considerado como um avanço na detecção de apo-Tf e holo-Tf, bem como em diagnósticos clínicos rápidos e de baixo custo.
Abstract: Cancer is the second leading cause of death globally, and was responsible for an estimated 10 million deaths in 2018, according to the World Health Organization. Several studies shown that transferrin is a potential cancer biomarker because tumour cells are able to overexpress high levels of transferrin compared with their normal counterparts. In this context, this paper describes the development of an electrochemical immunosensor for the detection of transferrin (Tf), in the forms apo-Tf (non-iron-bound) and holo-Tf (iron-bound). The immunosensor was based on the immobilization of the polyclonal antibody anti-transferrin (anti-Tf) by the method of covalent crosslinking, employing the zero-length agents 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and n- hydroxysuccinimide (NHS). As transducing surface, ITO (índium-tin oxide) slides have been used and the results were obtained by the adequacy of the experimental data to Randles equivalent circuit. All measures were performed by the electrochemical impedance spectroscopy (EIS) technique, in 4 mmol L-1 potassium hexacyanoferrate (II) prepared in phosphate buffer pH 7.4. The immunosensors characterization was performed using the technique of EIS and cyclic voltammetry (CV), evaluating the electrochemical response of apo-Tf and holo-Tf. It was observed that the devices developed were capable of detecting both forms of Tf, in terms of charge transfer resistance (Rct). The best experimental conditions were evaluated for the development of the immunosensors, performing studies about the measure of the geometrical area of ITO, the activation of the eletrodic surface, the mean of the antibody immobilization, the anti-Tf incubation time and concentration and the antigens incubation time. Analytical curves have been built for each antigen, using five levels of concentration in duplicate. It was performed an initial study for the full validation of the developed devices. For this, it was estimated the figures of merit of limit of detection (LOD) and of quantification (LOQ), precision and linearity, the last being statistical by linear regression and lack of fit test in the 95% level of confidence. Thus, the developed immunosensors were applied in the detection of two cancer cells A549 (lung cancer) and MCF-7 (breast cancer), comparing with the healthy kidney lineage cell BHK. Intending to evaluate if the obtained responses differ significantly from the control cells (BHK), it was performed an one-factor variance analys (ANOVA) and a Dunnett’s test in 95% confidence level. This way, it was observed that the impedimetric response of healthy cells differ significantly from the cancerous cells, indicates the immunosensors potential for cancer diagnosis. Thereby, the device constructed can be consider as an advance for the detection of apo-Tf and holo-Tf, as well as in fast and low cost clinical diagnosis.
Palavras-chave: Imunossensor impedimétrico
Espectroscopia de impedância eletroquímica
Detecção de transferrina
Validação
Impedimetric immunosensor
Electrochemical impedance spectroscopy
Transferrin detection
Validation
Área(s) do CNPq: CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade Estadual do Centro-Oeste
Sigla da instituição: UNICENTRO
Departamento: Unicentro::Departamento de Ciências Exatas e de Tecnologia
Programa: Programa de Pós-Graduação em Química (Mestrado)
Citação: Almeida, Sthéfane Valle de. DESENVOLVIMENTO DE IMUNOSSENSOR ELETROQUÍMICO PARA O MONITORAMENTO DE CÉLULAS CANCEROSAS. 2019. 77 f. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Química - Mestrado) - Universidade Estadual do Centro-Oeste, Guarapuava-PR.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://tede.unicentro.br:8080/jspui/handle/jspui/1582
Data de defesa: 22-Mar-2019
Aparece nas coleções:Programa de Pós-Graduação em Química Aplicada

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